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　　如何科學(xué)正確地使用凍存管呢？

　　凍存管的使用是一門(mén)學(xué)問(wèn)，并不是打開(kāi)液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡(jiǎn)單的三部曲可以完成的?？茖W(xué)正確地使用凍存管，可以避免樣本的損失，并保護試驗人員的安全。

　　凍存管有IATA航空運輸協(xié)會(huì )標準測試證書(shū)，常規儲存細胞培養物，組織樣品，微生物樣品(如病毒，細菌，酵母，真菌，孢子等)，人源或動(dòng)物源其它生物樣品(如血液，血清，精液，抗體，RNA, DNA和蛋白樣本)，不適合存儲再生醫學(xué)樣本。

　　冷凍步驟:

　　用預熱的PBS溶液洗滌細胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細胞(薄薄的液層足夠，胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據細胞系確定)。

　　37℃孵育細胞3-5分鐘。

　　細胞從底部脫離之后，終止孵育，加入含有血清的培養基，用移液器輕輕地懸浮細胞。

　　離心細胞懸液(500 x g, 5分鐘)，用含有血清的培養基重新懸浮。

　　細胞計數。

　　離心細胞懸液(500 x g, 5分鐘)，去除上清液，用適量體積的含有血清的培養基重新懸浮細胞。

　　以1:1體積比混合細胞和凍存液(60%培養基，20%胎牛血清，20% DMSO)，然后轉移到凍存管中。凍存的細胞密度為 1-5×106 個(gè)/毫升。

　　含有細胞的凍存管建議以−1 K / min 的速率降溫，可以將凍存管置于−70℃含有異丙醇的容器中。如果凍存管存儲其他樣品，可以直接放置在−20℃，−70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻，4 mL和5 mL的凍存管需要先置于在−20℃冰箱過(guò)夜，然后再轉移到−70℃或者液氮的氣相。

　　然后轉移凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮，請將凍存管置于液氮的氣相，切勿置于液相。

　　解凍步驟:

　　從液氮罐取出凍存的細胞后立即置于37℃水浴搖晃Cryo.sTM凍存管1-2分鐘。解凍過(guò)程需要越快越好。

　　轉移解凍的細胞于15 mL離心管，立即用大量的含有血清的細胞培養基混勻。

　　500 x g離心細胞5 分鐘，去除上清液，用適量的含有血清的細胞培養基重新懸浮細胞，然后轉移到細胞培養瓶。

　　按照建議的細胞濃度接種。

　　接下來(lái)的12小時(shí)細胞進(jìn)入靜默期。

　　間隔24小時(shí)和48小時(shí)更換培養基

　　如果細胞感染了病毒，也可以參考以上步驟進(jìn)行冷凍存儲和解凍的操作。

　　凍存管安全操作建議

　　凍存管用來(lái)存儲樣品，只能置于液氮氣相或冰箱。禁止凍存管浸沒(méi)于液氮液相，否則液氮可能滲入凍存管。因此，解凍時(shí)，蒸發(fā)的液氮產(chǎn)生高壓力，終導致凍存管炸裂，并且還將導致感染物質(zhì)釋放。

　　因此，操作凍存管時(shí)需要佩戴合適的個(gè)人安全防護措施，如穿戴安全護服、佩戴護目鏡、在安全櫥操作。

　　進(jìn)行冷凍保存時(shí)，凍存管需要緩慢地降溫至冷凍溫度。如果不是緩慢地降溫到冷凍溫度，將導致冰塞形成(如在凍存管頂部)，冰塞將阻礙液體形成凝固，將導致高壓力危險和后續的爆管風(fēng)險。