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　　貼壁細胞培養常見(jiàn)問(wèn)題分析及解決方法!
 

　　貼壁細胞在培養時(shí)要貼附于培養(瓶)器皿壁上，細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數生。貼壁細胞因其培養過(guò)程較為繁瑣，所以培養時(shí)更容易出現問(wèn)題。BUNSEN本生小編總結了貼壁細胞培養中常見(jiàn)問(wèn)題，并詳細介紹原因和解決方法，若培養時(shí)遇到這些情況，可參考對應解決方法處理。

　　一、貼壁細胞培養，細胞不貼壁

　　常見(jiàn)原因：胰蛋白酶消化過(guò)度;支原體污染;培養基pH值過(guò)堿(NaHCO3分解);細胞老化;接種細胞起始濃度太低或太高。

　　解決方法：縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度;分離培養物，檢測支原體。清潔支架或培養箱。如發(fā)現支原體污染，丟棄培養物;使用無(wú)菌醋酸溶液調整pH值或充入無(wú)菌CO2;啟用新的保種細胞;調節接種細胞濃度。

　　二、培養細胞生長(cháng)緩慢

　　常見(jiàn)原因：由于更換不同培養液或血清;培養液中一些細胞生長(cháng)必須成分如谷氨酰胺或生長(cháng)因子耗盡或缺乏或已被破壞;培養物中有少量細菌或真菌污染;試劑保存不當;接種細胞起始濃度太低;細胞已老化;支原體污染。
 

　　解決方法：比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長(cháng)實(shí)驗，讓細胞逐漸適應新培養液;換入新鮮配置培養液，或補加谷氨酰胺及生長(cháng)因子;用無(wú)抗生素培養液培養，如發(fā)現污染，丟棄培養物;血清需保存在-10到-20℃。培養液需在2-8℃避光保存。含血清培養液在2-8℃保存，需在1周內用完;增加接種細胞起始濃度;換用新的保種細胞;分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發(fā)現支原體污染，丟棄培養物。

　　三、細胞生長(cháng)周期變慢，邊養邊漂

　　常見(jiàn)原因及解決方法：

　　1、細胞傳代時(shí)密度太稀或太密：建議細胞密度達80%左右進(jìn)行傳代，傳代密度適中，密度過(guò)低會(huì )延長(cháng)生長(cháng)周期;

　　2、傳代操作不當：根據細胞特性決定細胞消化時(shí)間，一般在顯微鏡下觀(guān)察細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可終止消化，難消化的細胞可分次消化，每次時(shí)間不超過(guò)5min;頻繁換液或者清洗細胞也會(huì )導致細胞狀態(tài)變差，常規換液時(shí)間間隔為2~3天。

　　四、傳代后部分細胞漂浮

　　常見(jiàn)原因及解決方法：

　　1、傳代細胞密度太大：一般細胞匯合度達到80%時(shí)可進(jìn)行傳代操作，傳代密度需適中，傳代密度過(guò)高也會(huì )導致傳代后漂浮;

　　2、細胞狀態(tài)不好：可通過(guò)提高血清比例、穩定培養環(huán)境等方法進(jìn)行改善;

　　3、吹打次數過(guò)多造成機械損傷：輕柔吹打，細胞呈單顆粒時(shí)可停止吹打，吹打過(guò)程避免氣泡產(chǎn)生;

　　4、培養基更換后不適應：更換回原來(lái)的培養基;或者與原培養基比例混合后使用，使細胞有個(gè)適應期。

　　五、傳代后細胞全部飄起

　　解決方法：檢查所使用的培養基的顏色是否偏紫色，檢查瓶蓋是否透氣，不透氣瓶蓋是否被擰松。

　　通常培養基偏堿，顏色就會(huì )偏紫，主要是因為培養基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫，培養基量太少，或培養基存放時(shí)間太長(cháng)時(shí)都會(huì )變堿。建議配好培養基后分裝到50mL離心管并于一周內用完，量少時(shí)放到15mL離心管里保存。

　　六、傳代后細胞成團

　　解決方法：

　　1、低密度接種，延長(cháng)換液時(shí)間，防止細胞脫落;

　　2、使用多聚賴(lài)氨酸包被培養器皿，以增加細胞貼壁牢固度，降低細胞聚集成團的幾率;

　　3、重新鋪板，并更換新配制的培養基，加大血清比例(增加比例不超過(guò)5%);

　　4、接種時(shí)，減少培養基量(如T25加3mL)以加快細胞貼壁速度，等待細胞貼壁后(約8-12小時(shí))，再補加培養基到正常用量。

　　七、傳代后細胞變形

　　原因及解決方法如下

　　1)變形，但細胞還在生長(cháng)：可能是血清批次不一樣導致，血清成分復雜，不同批次和品牌間均存在成分差異，影響細胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清，更換血清時(shí)需與原血清比例混合后使用，使細胞有過(guò)渡期;

　　2)變形，但細胞不長(cháng)，且碎片增多：可能傳代操作過(guò)程損傷，常見(jiàn)于消化不當，或者潛在支原體等污染導致細胞病態(tài);消化時(shí)間根據每個(gè)細胞的狀態(tài)來(lái)調整，消化過(guò)度或者消化不充分均會(huì )對細胞造成影響;培養過(guò)程應嚴格無(wú)菌操作，實(shí)驗環(huán)境盡量潔凈，確保細胞無(wú)外源污染。

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