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問(wèn)題分析:超濾離心管常見(jiàn)問(wèn)題
更新時(shí)間:2023-08-30瀏覽:1419次

  問(wèn)題分析:超濾離心管常見(jiàn)問(wèn)題


  結果分析:

  1. 蛋白在濃縮時(shí)出現了沉淀為什么?

  蛋白如果濃縮過(guò)快或者過(guò)度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的最終濃度不超過(guò)20mg/ml. 對于對濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白,建議的改進(jìn)方法是:

  1)離心力降為推薦離心力的30%-50%。

  2)改選擇下一級過(guò)濾裝置(如原本選用10K,此時(shí)可以選擇30K)

  3)在濃縮過(guò)程中,取出超濾管,用槍頭反復吹吸幾次。

  2. 濃縮后發(fā)現濃縮液中沒(méi)有目的蛋白,可能的原因是?

  首先,超濾管的起始蛋白濃度為25ug/ml.

  請確保樣本的起始濃度大于這個(gè)濃度。

  其次,如果問(wèn)題仍然出現。

  請不要丟棄您的樣本濾過(guò)液,

  以做下一步分析:

  1)如果樣本在濾過(guò)液中,那么請排查:

  a) 是否選擇了合適截留分子量的超濾管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3)?

  b) 使用的離心力是否是在最高范圍內?如果使用的是rpm,請換算成相應的g離心,

  c) 離心機最近是否有校準過(guò)?

  d) 是否嘗試這個(gè)蛋白?如果能確保用同樣的超濾管對其他蛋白成功操作的話(huà), 那么有可能是目的蛋白的原因。有時(shí)蛋白會(huì )因其本身的一些特性(構象差異)而影響濃縮效果,建議選用上一分子量級別的超濾管(如原本選用30K,此時(shí)可以選擇 10K)。

  2)如果樣本也不在濾過(guò)液中:

  a) 樣本起始蛋白濃度是否大于25ug/ml?

  b) 用來(lái)確定樣本濃度的方法是什么?是否可信?

  c) 目的蛋白是不是沉淀了?如果是,具體解決方法請參考上面的關(guān)于蛋白沉淀的相關(guān)解決方法。

  3.用濃縮后的蛋白做下游分析時(shí)發(fā)現有干擾,可能原因?

  裝置的超過(guò)濾薄膜含有微量甘油。如果此材料干擾分析,可用緩沖液或超純水預清洗。如果干擾仍然存在,用0.1 N NaOH清洗,然后用緩沖液或Milli-Q® 水再次清洗后甩干。

  4. 有時(shí)候用超濾離心管連水都離不下來(lái),可能原因?

  裝置的超過(guò)濾薄膜含有微量甘油。如果出現這種情況,先用0.1 N NaOH清洗再離心。最后用緩沖液或Milli-Q®水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應立即使用, 如暫時(shí)不用,請保持潤濕狀態(tài),避免重新干燥。

  5.使用超濾管對蛋白進(jìn)行濃縮的過(guò)程中懷疑目的蛋白和膜之間可能存在非特異性吸附,如何改善這一現象?

  超濾管使用的是再生纖維素膜的材質(zhì),擁有極低的蛋白吸附能力。但是對于一些疏水性蛋白或非極性蛋白,它們和膜的非特異吸附可能會(huì )增強,對于這種情況,客戶(hù)可以嘗試在實(shí)驗前對超濾管進(jìn)行封閉處理,詳細步驟可聯(lián)系廠(chǎng)家技術(shù)支持。

  同時(shí)也可建議換成Amicon Ultra 0.5來(lái)進(jìn)行實(shí)驗,通過(guò)減小膜面積來(lái)降低非特異性吸附。

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