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　　ELISA實(shí)驗-如何降低ELISA背景

　　ELISA實(shí)驗的原理似乎很簡(jiǎn)單，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，間中夾雜著(zhù)洗滌和封閉。如何降低ELISA的背景，下面便是BUNSEN本生技術(shù)的詳解：

　　1 洗滌很重要

　　洗滌步驟看似很無(wú)聊，其實(shí)很重要，因為如果未結合的材料(如非特異結合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中，那么它會(huì )增加背景噪音。如有必要，可增加洗滌液中的鹽濃度，這會(huì )阻止非特異結合反應。如果背景過(guò)高，而您懷疑洗滌不夠時(shí)，可以嘗試增加洗滌次數。

　　2 封閉更關(guān)鍵

　　封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據微孔板中潛在的結合位點(diǎn)。這就降低了可產(chǎn)生信號的抗體非特異結合的機會(huì )。您當然也希望抗體只與目的蛋白結合吧。如果您的背景過(guò)高，懷疑封閉不充分，那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液，或適當延長(cháng)封閉時(shí)間。

　　如果您一直被背景問(wèn)題所困擾，那么也許您該花些時(shí)間來(lái)優(yōu)化封閉液。這可能需要時(shí)間，但也是值得的。目前主要有兩種類(lèi)型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑。您使用的類(lèi)型須取決于多個(gè)因素，包括微孔板的表面試劑、吸附的抗原、您的抗體和檢測試劑。好的封閉液應降低非特異性結合，但它不應當與抗原、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用。

　　常用的非離子型去污劑是Tween-20。這種封閉液便宜、穩定，在去除洗滌過(guò)程中的一些非特異結合上很有用。但它們只在存在時(shí)起作用，因為很容易被洗掉。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會(huì )降低特異結合，產(chǎn)生假陰性。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協(xié)助洗滌過(guò)程中的封閉。

　　蛋白封閉液則有所不同，。它們與開(kāi)放位點(diǎn)結合并封閉，同時(shí)穩定與微孔板結合的抗原分子。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、正常血清和魚(yú)明膠。血清組分的內在多樣性可使它有效攔截許多不同類(lèi)型的分子相互作用。不過(guò)，它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用。解決這個(gè)問(wèn)題的一種方法是使用雞或魚(yú)的正常血清。

　　3 抗體濃度須優(yōu)化

　　記住，非特異的抗體結合會(huì )增加背景。為了防止這一點(diǎn)，切勿使用過(guò)多的一抗或二抗。

　　4 檢測試劑要適量

　　切勿使用過(guò)多的檢測試劑。如果濃度過(guò)高，或者未正確稀釋?zhuān)瑒t會(huì )導致高背景。也不要顯色過(guò)度，如有必要，優(yōu)化一下何時(shí)應加入終止液。

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