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　　本生ELISA實(shí)驗技巧：酶標板分類(lèi)與性能判斷

　　本生酶標板作為ELISA檢測實(shí)驗中的輔材，起著(zhù)舉足輕重的作用并直接影響最終實(shí)驗結果，酶標板的好壞主要取決于其對蛋白吸附的靈敏度、板孔間蛋白吸附能力差異以及所采購酶標板批次間的差異。因此，選擇一款蛋白吸附靈敏度高、對蛋白吸附能力孔間差異小、批次間差異小的酶標板產(chǎn)品，是實(shí)驗者獲得可靠、穩定實(shí)驗結果的保障。

　　本生酶標板分類(lèi)：根據不同的分類(lèi)標準，酶標板有著(zhù)不同的分類(lèi)。

　　一、根據孔數，可分為96孔、48孔等，由于酶標板主要是配合酶標儀用，目前市面上的酶標儀最多為96孔，因此酶標板最為常用的也是96孔。

　　二、根據其底部的不同，又分為平底的，U型底、V型底等。平底的折射率低，適于在酶標儀檢測;U型底的酶標板折射率較高，方便加樣、吸樣、混勻等操作，可以不用放在酶標儀上，直接通過(guò)目測觀(guān)察顏色變化情況，從而判定有無(wú)相應的免疫反應。V底的酶標板可以精確的吸取樣品。

　　三、根據酶標板與蛋白和其它分子結合能力的不同，又分為高結合力、中結合力和氨基化等。

　　1) 高結合力

　　此種酶標板，表面經(jīng)處理后，其蛋白結合能力大大增強，可達300~400ng IgG/cm2，主要結合的蛋白分子量>10kD。使用該類(lèi)酶標板可提高敏感性，并可相對減少包被蛋白的濃度和用量，不足之處為較易產(chǎn)生非特異性反應?？乖蚩贵w包被后，以非離子去污劑無(wú)法有效地封閉未結合蛋白的部位，需使用蛋白作為封閉劑。

　　(2) 中結合力

　　此類(lèi)酶標板經(jīng)表面疏水鍵被動(dòng)與蛋白結合，適合作為分子量>20kD的大分子蛋白的固相載體，其蛋白結合能力為200~300ng IgG/cm2。由于該類(lèi)酶標板所具有的僅與大分子結合的特性，適用于作為未純化抗體或抗原的固相載體，可降低潛在的非特異性交叉反應。該類(lèi)板可以惰性蛋白或非離子去污劑作為封閉液。

　　(3)氨基化

　　這種酶標板經(jīng)表面改性處理后擁有帶正電荷的氨基，其疏水鍵由親水鍵取代。該類(lèi)酶標板適合作為小分子蛋白的固相載體。使用合適的緩沖液和pH值，其表面可通過(guò)離子鍵與帶負電荷的小分子結合。由于其表面的親水特性和可通過(guò)其它交聯(lián)劑共價(jià)結合的能力，可用于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污劑的蛋白分子。該類(lèi)板的缺陷為由于降低了疏水性，一部分蛋白分子無(wú)法結合;此外，其表面需有效地封閉。由于親水和共價(jià)的表面特性，使用的封閉液必須能夠與非反應性氨基基團和所選擇的交聯(lián)劑中任何功能基團發(fā)生作用。

　　四、根據顏色可分為透明、黑色、白色。

　　透明的是常用的，用于最一般的酶聯(lián)免疫實(shí)驗。相對于透明的的酶標板，還有用于發(fā)光檢測用的不透明的酶標板，一般有黑色和白色兩種。黑色的酶標板自身會(huì )有光吸收，所以它的信號相對于白色酶標板要低很多，因此一般用于檢測較強的光，如熒光檢測。而白色的酶標板就用于較弱的光檢測，常用于一般的化學(xué)發(fā)光。另外黑色的酶標板還可以消弱非特異反應帶來(lái)的問(wèn)題。同時(shí)需要注意的是，用一般的酶標板不可以進(jìn)行發(fā)光檢測，因為一般從化學(xué)發(fā)光反應中發(fā)射出的光是各向同性，如果用透明的酶標板，光不僅會(huì )從垂直方向發(fā)散，還會(huì )從水平方向發(fā)散，使得光極易通過(guò)各個(gè)孔之間的間隙和孔壁，從而導致各孔的光吸收值受到相鄰孔發(fā)射光的影響。

　　酶標板性能判斷

　　良好的酶標板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。酶標板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的酶標板在使用前須事先檢查其性能。

　　常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個(gè)讀數與全部讀數的均數之差，應小于10%。以下以A、B、C三款酶標板為例。

　　直接法：檢測Human IgG在酶標板表面的吸附

　　雙抗體夾心法：包被山羊抗人抗體檢測陽(yáng)性血清中抗原

　　由上圖可以看出，這三類(lèi)本生酶標板中，A類(lèi)酶標板具有更好的蛋白吸附效果，同時(shí)也提高蛋白吸附的靈敏度，能夠提供更為可靠的實(shí)驗數據。

　　另外，可以詢(xún)問(wèn)酶標板的批內差異，以下是某款酶標板的批內差異。

　　由批內差異數據圖可以看出，該酶標板具有很好地批間穩定性，批內變異系數(CV)差異均在5.0%附近，明顯低于業(yè)內關(guān)于臨床免疫反應用酶標板的質(zhì)量控制標準中批內變異系數低于10.0%的要求，因此也適合用于ELISA實(shí)驗。