聯(lián)系電話(huà):
18502669006
本生資訊:ELISA試劑盒細胞的裂解方法!
細胞裂解是改變細胞通透性和活性的重要實(shí)驗方法。那么,到底要如何裂解細胞呢? 不妨來(lái)看下本生生物的詳述:
對于培養細胞樣品:
1.融解ripa裂解液,混勻。取適當量的裂解液,在使用前數分鐘內加入pmsf,使pmsf的終濃度為1mm。
2.對于貼壁細胞:去除培養液,用pbs、生理鹽水或無(wú)血清培養液洗一遍(如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后,細胞就會(huì )被裂解。
對于懸浮細胞:離心收集細胞,用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒(méi)有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多,必需分裝成50-100萬(wàn)細胞/管,然后再裂解。
3.充分裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續的page、western和免疫沉淀等操作。
裂解液用量說(shuō)明:通常6孔板每孔細胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠,但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200微升或250微升。
對于組織樣品:
1.把組織剪切成細小的碎片。
2.融解ripa裂解液,混勻。取適當量的裂解液,在使用前數分鐘內加入pmsf,使pmsf的終濃度為1mm。
3.按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。)
4.用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。
5.充分裂解后,10000-14000g離心3-5分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續的page、western和免疫沉淀等操作。
6.如果組織樣品本身非常細小,可以適當剪切后直接加入裂解液裂解,通過(guò)強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清,用于后續實(shí)驗。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便,不必使用勻漿器,缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
注:ripa裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì )出現一小團透明膠狀物,屬正?,F象。該透明膠狀物為含有基因組dna等的復合物。在不檢測和基因組dna結合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續實(shí)驗;如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續實(shí)驗。如果檢測一些常見(jiàn)的轉錄因子,例如nf-kappab、p53等時(shí),通常不必進(jìn)行超聲處理,就可以檢測到這些轉錄因子。
技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng) 管理登陸 網(wǎng)站地圖