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　　BUNSEN本生：ELISA實(shí)驗操作的顯色和比色

　　(一) 顯色

　　顯色是ELISA中的后一步溫育反應，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(cháng)而呈色加強。

　　適當提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時(shí)間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴格控制，有時(shí)可根據陽(yáng)性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當縮短或延長(cháng)反應時(shí)間，及時(shí)判斷。

　　OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長(cháng)反應時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì )自行變色，顯色反應應避光進(jìn)行，顯色反應結束時(shí)加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

　　TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀(guān)察結果。但為保證實(shí)驗結果的穩定性，宜在規定的適當時(shí)間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。

　　TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間(12-24小時(shí))不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(cháng)(450nm)測讀吸光值。

　　(二)比色

　　比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著(zhù)的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。

　　在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。 比色時(shí)應先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔(未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過(guò)程的孔)，以記錄本次試驗的試劑狀況。

　　其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。

　　比色結果的表達以往通用光密度(oplical density，OD)，現按規定用吸光度(absorbence，A)，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(cháng)寫(xiě)于A(yíng)字母的右下角，如OPD的吸收波長(cháng)為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。

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